黃芪多糖的提取、分離與純化方法！
黃芪多糖(Astragalus polysaccharides, APS)是黃芪的主要活性成分之一，其提取、分離與純化工藝直接影響后續(xù)的結(jié)構(gòu)分析及活性研究。下面恒譜生分析檢測中心介紹從黃芪飲片出發(fā)，經(jīng)脫脂、水提、醇沉、脫蛋白、膜分離及柱色譜分離等一系列步驟，獲得不同分子量范圍均一組分的完整流程。
一、黃芪多糖的提取與脫蛋白
1. 粗多糖的提取
取黃芪飲片5 kg，粉碎后加入5倍量無水乙醇，回流脫脂2次，每次2小時。脫脂后的藥渣干燥，加入8倍量蒸餾水浸泡過夜，加熱提取3次，每次2小時。合并提取液，濃縮至適當體積，加入95%乙醇使乙醇終濃度達到80%，4℃靜置48小時。離心棄上清，沉淀用相同方法重復醇沉一次，得黃芪粗多糖。
2. 三氯乙酸法脫蛋白
將粗多糖用3500 mL蒸餾水超聲溶解，攪拌下緩慢加入等體積5%三氯乙酸(TCA)溶液，混勻后4℃冷藏24小時。取出后3500 r·min?1離心15分鐘，收集上清液。用飽和碳酸氫鈉(NaHCO?)溶液調(diào)pH至中性，濃縮至3000 mL。再加入95%乙醇至醇濃度80%以上，室溫靜置24小時，離心取沉淀，真空干燥，得脫蛋白后的黃芪多糖(APS)。
二、黃芪多糖的膜分離(分子量分級)
將上述APS用蒸餾水超聲溶解1小時，定容至3500 mL，轉(zhuǎn)移至膜分離系統(tǒng)儲液罐中。采用中空纖維膜，按分子量截留值由大到小依次分離。
操作步驟：
首先安裝150 kDa膜，調(diào)節(jié)壓力0.1 MPa，保持恒定流速。截留液返回儲液罐，濾液進入濾液罐。隨著儲液罐液面下降，適時補充蒸餾水沖洗，直至濾液經(jīng)Molish反應(取1 mL濾液，加等體積10% α-萘酚醇溶液，沿管壁滴加濃硫酸，無棕色環(huán)出現(xiàn))證實不含多糖為止。
收集截留液(>150 kDa)，并用少量蒸餾水反清洗膜表面，合并至截留液中。
將濾液(<150 kDa)轉(zhuǎn)移至儲液罐，依次更換100 kDa、50 kDa、20 kDa、10 kDa、6 kDa的膜，重復上述操作。
最終得到7個不同分子量范圍的黃芪多糖組分：
APS-A：>150 kDa
APS-B：150～100 kDa
APS-C：100～50 kDa
APS-D：50～20 kDa
APS-E：20～10 kDa
APS-F：10～6 kDa
APS-G：<6 kDa
各組分濃縮后冷凍干燥，備用。
三、黃芪多糖的含量測定(苯酚-硫酸法)
1. 葡萄糖標準曲線的繪制
精密稱取105℃干燥至恒重的無水葡萄糖標準品10 mg，蒸餾水溶解并定容至100 mL，得0.1 mg·mL?1標準溶液。分別精密量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于具塞試管中，加水補至2.0 mL。各加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻后迅速加入濃硫酸5.0 mL，混勻，室溫放置10分鐘，再于40℃水浴保溫15分鐘，取出迅速冷卻至室溫。以蒸餾水同法處理作空白，于490 nm波長處測定吸光度。以葡萄糖濃度(mg·mL?1)為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。
2. 樣品含量測定
精密稱取干燥的多糖樣品10 mg，蒸餾水定容至100 mL。取2.0 mL樣品溶液，按上述“標準曲線繪制”項下方法操作，于490 nm測定吸光度，平行測定3次取平均值，代入標準曲線計算多糖含量。
四、脫蛋白率測定(考馬斯亮藍法)
1. 試劑制備
精密稱取50 mg考馬斯亮藍G-250.用25 mL 95%乙醇溶解，加入50 mL 85%(W/V)磷酸，蒸餾水定容至500 mL，得0.01%(W/V)染色液。
2. 蛋白質(zhì)標準曲線的繪制
精密稱取牛血清白蛋白10 mg，蒸餾水溶解并定容至100 mL，得0.1 mg·mL?1標準溶液。分別量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于試管中，加水至1.0 mL，加入5.0 mL考馬斯亮藍染色液，混勻，放置3分鐘。以蒸餾水同法處理作空白，于595 nm處測定吸光度。以蛋白質(zhì)濃度(mg·mL?1)為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。
3. 樣品測定與脫蛋白率計算
精密量取脫蛋白前后的黃芪多糖溶液各1.0 mL，按上述方法測定吸光度，計算蛋白質(zhì)含量。脫蛋白率按下式計算：
脫蛋白率(%)=(1?脫蛋白后蛋白含量脫蛋白前蛋白含量)×100%脫蛋白率(%)=(1?脫蛋白前蛋白含量脫蛋白后蛋白含量?)×100%
五、黃芪多糖的柱色譜分離與純化
1. DEAE-Cellulose-52 離子交換柱色譜
分別稱取膜分離后的各組分(APS-A~G)1 g，溶于100 mL蒸餾水，離心取上清。上樣于DEAE-Cellulose-52色譜柱(80 cm × 3 cm)，依次用蒸餾水、0.1 mol·L?1 NaCl、0.2 mol·L?1 NaCl溶液進行梯度洗脫，每管收集5 mL。采用苯酚-硫酸法測定每管490 nm吸光度，繪制洗脫曲線。合并主峰流分，透析脫鹽，濃縮后冷凍干燥。
(同時取未經(jīng)膜分離的APS原樣，按相同條件進行離子交換柱色譜分離，作為對照。)
2. Sephadex G-100 凝膠柱色譜
取經(jīng)DEAE分離得到的各組分0.15 g，溶于10 mL蒸餾水，離心取上清。上樣于Sephadex G-100色譜柱，用蒸餾水洗脫，每管收集5 mL。苯酚-硫酸法測定490 nm吸光度，合并單一對稱峰的組分，透析后冷凍干燥，得到分子量均一的黃芪多糖精制組分。
總結(jié)
本文系統(tǒng)建立了黃芪多糖的提取、脫蛋白、膜分離分級、柱色譜純化及含量測定的完整方法。通過TCA法有效去除蛋白，膜分離技術(shù)實現(xiàn)分子量范圍的初步分級，再結(jié)合離子交換與凝膠過濾色譜，可獲得不同電荷特性和分子量均一的黃芪多糖組分。這一方法體系為黃芪多糖的結(jié)構(gòu)分析、活性篩選及質(zhì)量控制提供了可靠的技術(shù)支撐。
發(fā)布于: 2026-03-18